疫情之后，PCR技術成為了極度普及的基礎技術，各種產品如雨后春筍出現，其中熒光定量PCR競爭白熱化，產品開發已達平臺期。

在選擇新的技術方向時，數字PCR或許也是一種不錯的選擇。讓我們一起學習下...

1.數字PCR的概念

1988年，Kary Mullis驗證了基因在稀釋到極低的豐度（達到單分子水平）后，經過40個熱循環步驟依舊可以擴增到能夠檢測到的量。該實驗證實了單分子模板可以擴增的事實，為數字PCR單分子檢測技術打下了基礎。1992年，Sykes等人提出了一種基于有限稀釋的核酸定量方法，該方法提出了一個重要的原則：以“終點信號的有或無（all-or none end point）”作為反應單元陰陽性的判斷標志，該方法是數字PCR技術的理論基礎。1999年，Kinzler和Vogelstein等明確提出了數字PCR的概念，他們通過有限稀釋的策略，對致癌基因KRAS突變型進行了定量分析。如圖1-1所示，首先，DNA樣本被稀釋到很低的濃度，約0.5個拷貝每孔，然后把樣本分散到獨立的反應單元內，并在經過優化的實驗條件下進行PCR擴增；然后，加入熒光探針，對每個獨立反應孔內的熒光信號進行檢測分析，根據熒光信號強度判斷每一個獨立反應單元內的PCR擴增產物中是否存在野生型和突變型DNA序列；最后根據相應比例的突變和野生DNA數目，進行突變頻率的判定。該實驗限于當時技術條件的局限性，樣本分割的過程是在384孔板中進行的。其操作過程的復雜性，限制了數字PCR技術的發展，導致數字PCR在較長的一段時間內，發展相對緩慢。

圖1數字PCR技術原理。

2. 基于泊松分布的核酸定量原理

圖2是數字PCR的檢測流程，數字PCR最核心的技術策略在于把模板分子隨機的分配到數萬甚至數百萬個獨立的反應單元中，理想狀態下使每個反應單元中包含1個或者不包含模板分子，被分割的模板分子在獨立的反應單元內進行擴增反應，在擴增終點，通過熒光染料或探針技術檢測每一個獨立反應單元中的熒光信號，根據信號差異，可以直接計數出出含有模板分子的反應單元個數，進而直接實現反應液中模板分子濃度的定量。然而，在實際操作中，模板分子在隨機分散時會出現兩個甚至多個模板分子進入到同一個反應單元內的情況發生，而在擴增終點，含有模板分子的反應單元具有相同的熒光強度，難以區分多個模板和一個模板的反應單元。所以，簡單的通過陽性分區的個數來直接統計模板分子個數的方式會導致定量結果出現較大的偏差，尤其是在模板濃度較高的情況下。為了解決這個問題，多種統計學方法被用來進行數字PCR的模板分子定量。其中，最常用的一種統計學方法是泊松分布。

圖 2 數字PCR檢測流程。

基于泊松分布的數字PCR定量原理可以簡單描述如下：假設模板分子在溶液中是均勻分散的，個分子隨機分布到個反應單元中，這種情況對應于一個二項式過程，即每個過程的結果要么出現要么不出現，并且重復次。目標分子出現在一個反應單元中的概率是，因為它是隨機事件或獨立事件的結果。一個反應單元有次機會分配到一個目標分子。一個反應單元在一次分配之后為空的概率是，在次嘗試之后是，最后為空的反應單元的概率。在很大(很小)的情況下，()可以看作是的一階近似。因此，概率可以近似為，這里λ為反應單元中所含有的平均分子拷貝數，為陰性反應單元數目。因此，已知陽性反應單元個數，即可實現原始樣本中模板分子的定量，平均分子拷貝數，這個公式定義了數字PCR泊松分布的概率函數。

3. 數字PCR技術優勢

數子PCR技術與第一代PCP（定性PCR技術）、二代PCR技術（相對定量PCR技術）相比，具有很多優勢：

1）特異性、靈敏性均有顯著提高；

2）在不依賴內參和標準曲線的前提下，直接得到絕對定量結果；

3）不需要大量復雜的相對定量計算，直接呈現靶分子原始濃度/拷貝數；

4）微反應單元相互獨立、封閉，避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴增產物間的相互干擾，極大的提高了檢測的準確度和可重復性。

表1. 數子PCR與熒光定量PCR技術比較

	數字PCR（dPCR）	熒光定量PCR（qPCR）
檢測靈敏度	0.01%(高)	1%（低）
是否絕對定量	是	否
特異性	高	一般
數據重復性	高	一般
是否需要標準曲線	否	是
檢測方法	Taqman探針和染料法	Taqman探針和染料法
抗干擾能力	很強	弱
檢測價格	略高	低

4.  數字PCR技術路線——固相分割技術 vs 油包水分割技術

數字PCR根據液滴分割方式的不同，數字PCR產品主要分為固相分割芯片和油包水式等。不論是哪種形式的數字PCR產品，整體上都由微反應單元生成、擴增信號檢測與分析兩個部分組成。

其中，微流控芯片式的體系兼容性更高，芯片工藝較為復雜；油包水系統簡單，但是體系變化時易發生破裂和融合，導致定量結果出現偏差。

表2. 數字PCR技術路線比較（微孔固相分割技術 vs 油包水分割技術）

數字PCR技術路線	固相分割法	油包水分割法
液滴均一性	均一性高，cv<1%	均一性弱，cv>5%
有效液滴率	高，>95%	低，<80%
信號信噪比	高，陰陽性信號區分能力高	低，陰陽性信號區分能力弱
第三方試劑兼容性	兼容第三方試劑，快速開發應用試劑盒，使用成本低	不兼容，試劑封閉，應用開發慢，使用成本高

5. 數字PCR市場和應用

目前，在我國市場中用于基因檢測的技術主要分為PCR技術、基因測序技術、FISH技術和基因芯片技術四種。其中PCR技術包括普通PCR、熒光定量PCR和數字PCR。測序包括一代測序、二代測序和三代測序等。

根據技術和市場發展進度，數字PCR屬于快發展階段，在臨床檢測、科學研究、生物制藥和計量等領域發揮著不可替代的作用。

圖3 數字PCR發展階段

作為第三代的PCR技術，數字PCR具有獨特的應用優勢。

在腫瘤伴隨診斷方面：數字PCR通過檢測患者血液DNA/RNA，可以了解患者腫瘤發生發展，如通過血液檢測肺癌EGFR、BRAF、KARS等基因實現腫瘤伴隨診斷。

另外，數字PCR被譽為基因檢測領域，靈敏度最高（0.01%）的檢測技術，對于很難取得腫瘤組織的樣本，數字PCR可以通過檢測體液樣本（血液、唾液、尿液和痰液等）實現腫瘤檢測。

在遺傳生殖方面：數字PCR具有極佳的信噪比，在遺傳生殖方面發揮了巨大作用，如SAM，NIPT等檢測。目前NIPT主要用高通量測序技術，但是檢測時間長、成本高、需要專業的技術團隊，而且很難在院內落地，尤其是二/三線城市醫院。數字PCR檢測只需要4小時左右，相比NGS可以降低2/3的成本，可以很快在二/三線城市醫院落地，具有更高的經濟效益。

對于SMA的檢測：數字PCR可以同時檢測SMN1和SMN2，國內SMA治療藥物已經進入醫保，SMN2的定量檢測可以指導用藥，而數字PCR可以精準實現SMN2拷貝數定量，其作用也是不可替代的。

針對病原微生物和食源性致病菌檢測：數字PCR檢測時間是3小時左右，可實現快速、精準的定量檢測需求。

小海龜超多重數字PCR單個反應可以同時檢測15-20種病原體，滿足病原體超多重檢測的需求。

在計量研究領域：數字PCR是核酸標準品定量的行業標準；

在核酸藥物質控領域：數字PCR是rAAV、mRNA疫苗、Car-T等生物藥的最佳劑量質控技術。

對于環境微生物：數字PCR具有極高的抑制物耐受性，可以精準實現環境DNA定量監控，適用于多種生態學研究。

圖4  數字PCR熱門研究方向